Наследственность у бактерий: от Ламарка к Дарвину и обратно

11.09.2012

 

 

Наследственность у бактерий: от Ламарка к Дарвину и обратно

Лекция Константина Северинова

10 июня 2010, 06:58

Текст лекции

Константин Северинов (фото Н. Четвериковой)
Константин Северинов 
(фото Н. Четвериковой)

Я благодарен организаторам за приглашение, это большая честь для меня. Я чувствую себя смущенным, у меня нет никакого опыта презентаций и публичных лекций. Если я буду говорить что-то слишком специальное, меня можно препрывать прямо по ходу лекции. За минуту до того, как я вышел сюда из дома, я получил замечательный е-мейл, который, по-видимому, рассылается многим ученым, а также всяческому начальству. В этом послании предлагается срочно прекратить обучение теории эволюции в школах, как учения вредного, ну и так далее. Т.е., вопросы, связанные с теорией эволюции, продолжают волновать людей, особенно городских сумасшедших. Не вдаваясь в подробности “аргументации” автора послания, я хочу сразу сказать, что на самом деле совершенно не буду говорить про теорию эволюции как таковую, a расскажу о тех молекулярных механизмах, которые обеспечивают наследственные изменения у бактерий. И я буду концентрироваться на методах, подходах и экспериментах, на том, как думали те ученые, которые ставили классические эксперименты на эту тему. Давайте определим концептуальное поле, в котором мы будем находиться. Эволюция по Ламарку построена на идее наследуемых адаптаций. Основной тезис заключается в том, что в ответ на изменения окружающей среды особи способны меняться или приспосабливаться, а затем каким-то образом передавать приобретенные изменения потомству. В принципе, у Ламарка была еще прогрессистская идея, заключавшаяся в том, что приспособления приводят к постепенному усложнению организации организма, последовательной эволюции от простого к сложному, но, на самом деле, это требование не существенно для основной идеи. Теория Ламарка в принципе совершенно разумна, она объясняет существующее многообразие живых существ и те изменения, которые виды претерпевают при изменении окружающей среды. Но есть несколько вопросов. Те вопросы, которые мне, например, интересны, как молекулярному биологу, это, во-первых, каков механизм адаптации, и, во-вторых, какова природа наследования признаков, которые организм приобретает под действием окружающей среды. Если мы опишем такой механизм, то мы вынуждены будем признать, что эволюция по Ламарку имеет место быть.

По Дарвину основными факторами эволюции являются изменчивость и отбор. Тезисы здесь такие: во-первых, постулируется, что между особями одного вида существует изменчивость. Во-вторых, особи, обладающие подходящими признаками, оставляют больше потомства. Третий тезис - это то, что признаки наследуются. Четвертым тезисом является утверждение, что ресурсы ограничены, и поэтому размножение особей ограничено доступностью ресурсов. Приняв эти тезисы, можно задать следующие вопросы: во-первых, какова природа изменчивости? Очевидно, что без изменчивости не будет отбора. Вторым будет тот же самый проклятый вопрос, который у нас был в случае Ламарка, а именно - какова природа наследуемости подходящих признаков? Когда Дарвин предложил свою теорию, у него не было ответа на второй вопрос, и это создавало массу проблем.

Борис Долгин: Природа в смысле — механизм?

Константин Северинов: Природа — это механизм. Механизм — это какая-то машинка внутри, которая обеспечивает наследуемость.

Каждый из предложенных механизмов эволюции имеют право на существование, остается только выяснить, какой из них существует в реальности. Если мы найдем механизмы, обеспечивающие как наследование приобретенных признаков, так и изменчивость и наследуемость предсуществующих признаков, оказавшихся подходящими для данных условий, то мы должны будем признать, что существуют оба механизма эволюции. Если мы покажем существование только одного механизма, мы сделаем выбор в пользу одной из двух теорий эволюции. Но мы будем сохранять “open mind”. Мы будем готовы а priori признать существование обеих возможностей. Каким способом можно изучать механизм эволюции? Самая общая методология, по-видимому, должна быть такой: мы возьмем популяцию какого-то организма, создадим условия контролируемого изменения окружающей среды и будем следить за происходящими в популяции изменениями, концентрируя наше внимание на определенных признаках. При этом, так как и дарвиновская, и ламарковская схемы предполагают очень медленные изменения, нам придется следить за популяцией в течение многих поколений. Кроме того, изменения, как правило, происходят редко, и нам нужно будет следить за большим количеством особей. Организовав такой исследовательский процесс, мы можем на основании анализа результатов выбрать ту теорию, которая лучше соответсвует экспериментальным данным. То, чем мы будем заниматься, будет называться генетика. После того, как мы выбрали общую схему эксперимента, давайте решим, кого мы будем изучать. Можно изучать человека или популярные модельные организмы, например, мышь, муху, дрожжи, бактерии, вирусы. Выясняется, что различные модельные организмы неодинаково хорошо приспособлены для решения задачи, которую мы хотим решить. Проблема в том, что для опыта, который мы хотим поставить, очень важным является время генерации организма, размер популяции и количество признаков, за которыми можно следить. Человек для нас не будет являться хорошим объектом изучения, потому что мы не сможем проследить эволюцию человека в течение нашей собственной короткой жизни. До середины XX века классическим объектом генетики была плодовая мушка дрозофила. И с помощью этой мухи Томас Хант Морган, величайший ученый масштаба Дарвина и Ньютона, которого мы в основном знаем по классово чуждому морганизму и вейсманизму, разработал хромосомную теорию наследственности. Морган начинал свои исследования, не будучи поклонником Дарвина. Но поизучав эту муху, он пришел к выводу, что “эволюция, понимаемая как изменение частоты призанаков в популяции, по-видимому, происходила за счет включения в расу (для нас это вид) случайных изменений, которые создают превосходство в жизни или воспроизводстве индивидуального организма”. На самом деле, это дарвиновская концепция. Хромосомная теория наследственности, которая была сформулирована Морганом и его школой, постулировала, что гены, которые кодируют признаки, находятся на хромосомах, и распределяются в популяции, или в потомстве, по законам Менделя. Дальнейшее развитие хромосомной теории сдерживалось особенностями модельного организма (мухи). Например, хромосомная теория наследственности постулировала, что ген един и неделим. Связано это было с тем, что время генерации плодовой мушки, количество особей, которые реально можно проанализировать, и количество признаков, по которым можно мутантную муху отличить от нормальной мухи, ограничивали разрешение генетического анализа, не позволяли заглянуть внутрь гена. Между тем, ученым хотелось понять молекулярную природу наследственности. Существовало (правильное) мнение, что понимание наследственных изменений на молекулярном уровне позволит описать тот механизм, ту машину, которая обеспечивает эволюцию. Причина, почему Морган и его соавторы, изучая муху, пришли к пределу, показана на слайде. Здесь изображена хромосома - такой, какой она видна в световой микроскоп, а слева показан фрагмент молекулы ДНК, участок гена, содержащий 6 или 7 витков спирали.

Так вот на хромосоме находятся тысячи разных генов. Если вы глядите на хромосому с разрешением светового микроскопа, то большинство генов для вас просто “сольются”, и вы, конечно, не увидите тонкую структуру гена, которая связана как раз с этой молекулой ДНК. Смена экспериментальной модели, переход к изучению бактерий, позволил приблизиться к молекулярному пониманию гена, и связано это с тем, что эти зверюшки быстро делятся, их можно получать в огромных количествах и, вообще, с ними очень легко работать. Осознание этого факта пришло группе физиков, которые решили в конце 30-х годов, расправившись с квантовой теорией, заняться биологией, потому что они увидели там достойный объект приложения своих недюжинных талантов. Однако при смене экспериментальной модели возник законный вопрос: а кто вообще сказал, что то, что мы знаем про эволюцию высших организмов, применимо к бактериям? Поэтому перед тем, как заняться изучением генетики бактерий, нужно было показать, что у них есть гены в том смысле, в каком мы привыкли про них думать, изучая муху и других животных. И первый эксперимент, про который я расскажу, он как раз насчет этого. На самом деле, я в течении всей лекции буду вам рассказывать про один и тот же эксперимент, трижды проделанный на протяжении последних 70-ти лет. И все три раза были получены совершенно разные результаты, и все три раза результаты были правильные. Возможно, в будущем этот эксперимент будет сделан еще и в четвертый, и в пятый раз и опять будет получено что-то совершенно новое и нетривиальное. Я очень люблю этот эксперимент; он поразительно простой. Сейчас есть много заявлений с высоких трибун по поводу реформирования российской науки, в частности, считается, что нужно срочно изменить и улучшить приборную базу, так вот - приборная база этих классических экспериментов такова, что их можно сделать дома на кухне. Тем не менее, ряд ученых получили нобелевские премии за эти “простенькие” эксперименты.

Экспериментальная система: возникновение мутантов бактерии E. coli, устойчивых к фагу

Итак, каков механизм возникновения мутаций (наследственных изменений) у бактерий? Мы экспериментаторы, поэтому я все время буду уделять внимание конкретному эксперименту, как все реально делается. Мы будем изучать возникновение мутантных бактерий Е. coli — кишечной палочки — устойчивых к вирусу, который называется фаг, в популяции исходных бактерий, которые к фагу чувствительны. Что это значит? На слайде показан бактериальный вирус, у него есть головка, в которой находится генетическая информация вируса, есть хвостик и есть фибриллы — вообще, он очень похож на шприц. На электронной микрофотографии в правой части слайда можно видеть, как такие вирусы своими фибриллами присоединяются к огромной, по сравнению с ними, черной штуке, это отдельная клетка кишечной палочки. После того, как вирусы присоединились к клетке, они впрыскивают свою генетическую информацию внутрь и через 20 минут этой бактерии больше не будет, она лизируется, разваливается, и из нее выходят 100-200 новых вирусных частиц, готовых к тому чтобы заразить следующую бактерию. На микрофотографии запечатлен акт так называемой продуктивной инфекции, вирусы очевидно смогли присоединиться к бактерии, т.е., оказались способны ее заразить. Но бактерии могут становиться устойчивыми к вирусу. Природа этой устойчивости для нас не очень важна, но самый простой пример механизма устойчивости — это когда специальные рецепторные молекулы, находящиеся на поверхности чувствительной клетки, изменяются таким образом, что вирус больше не способен узнать, присоединиться к клетке. Такая клетка становится устойчивой к вирусу. Так вот, мы будем изучать, как клетки кишечной палочки становятся устойчивыми к вирусу, который называется бактериофаг Т1. Клетки бактерий, устойчивых к вирусу, образуют колонии на чашках Петри, содержащих бактериофаг. Чувствительные клетки колоний не образуют, потому что они уничтожаются вирусом. Если мы на чашку, содержащую вирусные частицы, высадим очень большое количество чувствительных клеток (несколько миллиардов), то некоторое, очень небольшое количество колоний все таки образуется. На следующем слайде показан результат такого опыта. Колонии, которые вы видите на этой чашке Петри, видны невооруженным глазом, их диаметр около миллиметра. Каждая из этих колоний являются потомком одной клетки, которая начала делиться, попав на питательную среду. Она начала делиться, потому что она устойчива к вирусу, который в очень больших количествах присутствует на чашке. Там где бактериального роста нет, там просто вирусы съели бактерий. Т.е., клетки чувствительных к вирусу бактерий колоний не образуют.

Клетки бактерий, устойчивых к фагу, образуют колонии на среде, содержащей фаг

Клетки чувствительных бактерий колоний не образуют

Легко продемонстрировать, что клетки, находящиеся в составе выросших колоний, устойчивы к вирусу, и способны передавать это свойство своему потомству. Колонии устойчивых клеток очень легко и удобно пересчитывать. Все мы умеем считать. Можно взять и посчитать, сколько колоний выросло на этой или какой то другой чашке. Мы, собственно, этим и займемся. И с помощью таких простых подсчетов, мы определим, как возникают мутации у бактерий: по ламарковскому или дарвиновскому механизму.

Итак, как же возникают устойчивые бактерии? Если мы придерживаемся ламарковской парадигмы, мы должны сказать, что в отсутствие вируса устойчивых бактерий быть не должно. Бактерии становятся устойчивыми к вирусу в ответ на изменение окружающей среды, в ответ на то, что мы добавили вирус. С другой стороны, если мы находимся в рамках дарвиновской парадигмы, то мы должны сказать, что за счет имманентной изменчивости в популяции бактерий всегда присутствуют спонтанно возникшие, устойчивые к вирусу бактерии. А вирус просто выступает в качестве агента отбора. Вирус — это карающая “длань господня”, которая пришла и отделила зерна от плевел. Как же нам выяснить, что происходит на самом деле? Давайте проведем мысленный эксперимент. Посмотрим, что должно происходить в случае ламарковской ситуации, когда мутации устойчивости к бактериофагу возникают только после контакта с ним. На слайде схематически изображен голубенькая бактериальная клетка, которая размножается путем деления. После первого деления возникло две дочерние клетки. Произошло еще одно деление, дочерние клетки поделились, стало четыре клетки, затем восемь. После четырех делений у нас получилось 16 клеток. А теперь эти 16 клеток высеяли на питательную среду, которая плотно заселена вирусом. До того, как вирус был предложен этим клеткам, они знать про него не знали и были к нему чувствительны, как и исходная клетка. Пусть в ответ на появление вируса с какой-то частотой возникают устойчивые к нему клетки. Первый раз мы высеяли наши 16 клеток на чашку с вирусом, и так получилось, что у нас выросли три устойчивые колонии. Т.е., три из шестнадцати клеток приобрели устойчивость за счет какого-то адаптивного ответа на вирус. Проведем эксперимент еще раз, опять начав его с единичной (другой) чувствительной клетки. Во второй раз у нас выросла одна колония. В третий раз — сразу пять. А в четвертый раз ничего не выросло. Очевидно, что есть какой-то разброс, но в целом наши данные позволяют расчитать некоторую среднюю вероятность адаптации каждой клетки к вирусу.

Сценарий 1 (ламарковский): мутации устойчивости к фагу возникают после контакта с ним

Теперь давайте посмотрим на дарвиновский сценарий, когда мутации возникают спонтанно и лишь отбираются при добавлении вируса. Вот опять пошла наша клетка делиться, после третьего деления у одной дочерней клетки спонтанно возникла устойчивость, но вируса еще нет. Устойчивая клетка, как и все остальные, поделилась еще раз и дала две дочерние клетки, которые тоже устойчивы Мы высеяли наши 16 клеток на селективную среду с вирусом. И у нас выросли две колонии. В общем, никакой принципиальной разницы с тем, что было до этого, мы пока что не наблюдаем.

Сценарий 2 (дарвиновский): мутации предсуществуют, возникают спонтанно и отбираются при добавлении фага

Давайте повторим этот эксперимент еще раз. В этот раз у нас спонтанных мутаций устйчивости не возникло. Все клетки чувствительны, и при высеве на среды с вирусом не выжил никто, т.е., мы вообще не наблюдаем колоний. И в третьем эксперименте тоже так случилось. Пустая чашка!

Сценарий 2 (дарвиновский): мутации предсуществуют и отбираются при добавлении фага

Мы делаем еще один эксперимент. И тут случилось так, случайно - ведь мутации возникают спонтанно, - что клетка возникла очень рано, после первого деления материнской клетки. И она давала потомство, так же, как и все остальные. К моменту, когда мы высеяли всю эту культуру, состоящую из 16-ти клеток, на селективную среду, половина клеток оказались устойчивыми.

Сценарий 2 (дарвиновский)

Теперь вопрос: можем ли мы сказать, какой механизм более вероятен: дарвиновский или ламарковский, - просто глядя на количество устойчивых к вирусу колоний, наблюдаемых при повторении нашего простого эксперимента? На следующем слайде одновременно представлены результаты четырех независимых повторений нашего мысленного экаперимента для ламарковского и дарвиновского механизмов. Черным отмечены клетки, которые дали колонии на селективной среде.

Всего бактерий 256 (4x64)
Устойчивых мутантов: 10

В целом, распределение устойчивых колоний в случае ламарковского механизма представляется довольно равномерным. А в случае дарвиновского механизма распределение очень неровное, у нас есть, где пусто, а есть, где густо. При этом общее количество устойчивых клеток у нас для обоих механизмов одинаковое, для обоих механизмов мы в четырех сериях эскпериментов высевали на среды с вирусом 256 (4 по 64) клеток и получали 10 устойчивых колоний. Т.е., общая частота возникновения устойчивых колоний одинаковая, но распределение их разное. Можно применить математику и показать, что в случае ламарковского механизма имеет место хорошо известное пуассоновское распределение числа устойчивых колоний в разных сериях экспериментов, а в случае дарвиновского механизма — специальное распределение Лурии и Дельбрюка, названное так в честь тех людей, которые решили загадку о том, как же возникают мутации у бактерий. Вы можете на это смотреть таким образом: если в случае ламарковского механизма мутации возникают как бы одномерно, в самый последний момент, то в случае дарвиновского механизма вы как бы добавляете еще одно измерение, вы должны учитывать время, историю. При раннем возникновении устойчивой клетки она вносит непропорционально большой вклад в общее количество устойчивых колоний, которые вы обнаруживаете в конце эксперимента. Итак, дарвиновское распределение будет гораздо менее равномерным, чем ламарковское, и есть математика, которая позволяет строго сказать, насколько именно большей должна быть эта неравномерность.

Вопрос из зала: Можно спросить, в чашке территориально — куча колоний будет, или они все перемешиваются?

Константин Северинов (фото Н. Четвериковой)
Константин Северинов 
(фото Н. Четвериковой)

Константин Северинов: Мы растим наши клетки в жидкой культуре, и они там все равномерно перемешаны. Представьте себе, что у вас есть пробирка, в которой есть жидкая среда, и бактерии там растут, делятся. Вообще, вы очень правильный вопрос задаете, мы сейчас собственно и переходим к анализу результатов настоящего, а не мысленного эксперимента.

Итак имеется 8 пробирок с одинаковым обьемом жидкой среды, бульона, и мы посадили в каждую пробирку по 1 клетке. Мы умудрились, мы взяли нанобиоманипулятор, поймали по одной клетке за хвост и посадили их туда. А потом разрешили им делиться. Дочерние клетки, естественно, у нас в этой среде равномерно перемешались. После некоторого периода роста, все содержимое каждой пробирки мы высеяли на чашку, подобную той чашке, которую я вам показывал. При этом, так как чашка большая, а бактерий у нас немного, то каждая из бактерий окажется далеко от другой, но вокруг этих бактерий будет масса вирусов, фагов. Потому что у нас среда селективная, мы на эту чашку посадили вирусы. Все чувствительные клетки будут просто съедены вирусом. А устойчивые клетки начнут делиться, потому что им, что есть фаг, что нет — все равно, и образуют колонию. И мы будем считать просто колонии.

Вопрос из зала: То есть мы помещаем в каждой чашке понемногу, а здесь в каких-то ничего, а в каких-то есть?

Константин Северинов: Да, да, да. Это собственно то, что мы и увидим.

Эксперимент, который мы обсуждаем, был сделан двумя очень молодыми людьми, Максом Дельбрюком и Сальвадором Лурия. На этом слайде они сфотографированы в конце 40-х годов в американской лаборатории Колд Спринг Харбор, где проводились и сейчас проводятся замечательные курсы и конференции по разным биологическим темам. Дельбрюк - немец, который убежал из фашистской Германии, а Лурия - еврей, который убежал из Италии Муссолини. Они встретились в 1942 г. на конференции в Филадельфии.

Они работали в разных концах Соединенных Штатов, и оба интересовались проблемой природы гена и вопросами изменчивости и наследуемости признаков у бактерий. Дельбрюк был физик, биологии его в свое время якобы научил Тимофеев-Ресовский. А Лурия был очень хороший бактериолог, и он на протяжении довольно длительного времени пытался в реале делать тот опыт, который мы с вами сейчас проделывали мысленно. Но он никак не мог сделать какой-нибудь вывод из своих результатов. У него не было математического аппарата, который позволил бы ему интерпретировать данные. Он был готов к любому варианту механизма возникновения устойчивых к бактериофагу бактерий, но не мог их отличить. Ему Дельбрюк в этом помог. Их экспериментальные результаты, опубликованные в 1943 году, показаны на слайде.

Экспериментальная проверка (тест Лурии — Дельбрюка)

Здесь в таблице есть две колонки. В колонке слева показаны результаты, полученные с 20 отдельными культурами — 20 пробирками (culture number). В каждой пробирке был тот пресловутый 1 мл бульона, и туда было посажено небольшое количество бактерий. Бактерии росли, делились, а потом все содержимое каждой культуры высевалось на среду с фагом, и подсчитывались устойчивые колонии. И вот что вы здесь видите: есть 0 и 1 и 5 устойчивых колоний, но в некоторых культурах есть 107, 64 и 35. Наблюдаемое распределение числа устойчивых колоний характеризуется средним (оно около 11) а также дисперсией. Так вот - дисперсия здесь совершенно чудовищная, и то, что она действительно большая, показывают данные в правой части таблицы, про которые я вам не буду говорить, но в целом результат вполне строго доказывает, что ситуация соответствует дарвиновскому механизму, а не ламарковскому. Т.е. у бактерий есть изменчивость, которая наследуема, которая возникает спонтанно, и при отборе происходит выживание вариантов, приспособленных с измененным условием окружающей среды. С другой стороны, результат также показывает, что, по-видимому, у бактерий нет способности адаптивно отвечать на изменения окружающей среды путем приобретения полезных для них признаков. Если бы это было, мы бы имели пуассоновское распределение числа устойчивых колоний между культурами.

Вопрос из зала: То есть в каждой пробирке что-то было бы?

Константин Северинов: Да, мы как раз это и видим в правой колонке таблицы. Там показано вот что: 10 раз высевалось по одному о тому количеству культуры из одной общей культуры. И в этом случае вы просто видите чисто статистическую разницу в количестве колоний на разных чашках.

Вопрос из зала: Скажите, а здесь зафиксировано ожидаемое значение устойчивых — 11 или 16?

Константин Северинов: Это не ожидаемые, это определенные в эксперименте средние значения, т.е. мы взяли 20 чисел в левой колонке, сложили и поделили на 20. И то же самое проделали с 10 числами в правой колонке. Видно, что у вас значения средних в обеих колонках близкие, а значения дисперсии отличаются очень сильно.

В биологии есть одно интересное свойство: почти все ответы можно получить очень простыми методами, особенно, если знаешь, что ищешь. После того, как ответ был получен с привлечением математики, которая для большинства нормальных биологов неродная, они сказали: ну конечно же! - и сделали вот такой простейший опыт, который показывает то же самое, что и опыт Лурии-Дельбрюка. Представим, что у нас есть чашка Петри, показанная на слайде. Эта чашка Петри очень густо засеяна чувствительными к бактериофагу бактериями, мы даже не видим отдельных бактерий, они образуют сплошной газон. Допустим, что на этой чашке спонтанно, с определенной частотой, возникли устойчивые к вирусу клетки. Их потомство в этом бактериальном газоне присутствует, но мы, конечно, его не видим. Давайте найдем способ их увидеть. Возьмем такую специальную “высокотехнологическую” штуку, которая называется “перепечатка” — это такая кругляха, соответствующая по диаметру нашей чашке, и на нее натянут бархат, к которому хорошо прилипают бактерии. Вот мы этим штампом возьмем и коснемся нашего бактериального газона и перепечатаем бактерии, задержавшиеся на бархате, не на одну, а сразу на 3 чашки, засеянные вирусом. На всех трех чашках возникнут устойчивые колонии и относительное расположение этих устойчивых колоний на всех трех чашках будет одинаково.

Доказательство спонтанной природы мутаций методом перепечатков

О чем это говорит? Говорит ли результат о том, что у нас скорее дарвиновский механизм? Да, потому что идентичность паттерна устойчивых колоний означает, что устойчивые бактерии пресуществовали на исходной чашке. Мы их просто отобрали с помощью бактериофага. Т.е. наш бактериальный газон - это такой бактериальный “город” или “страна”, в которой есть масса мутантов или, если хотите, индивидуальностей. Мы о них ничего не знаем, но мы можем их отобрать. Если бы у нас ламарковский механизм, если бы бактерии отвечали на изменение условий путем приобретения устойчивости, в нашем случае - к вирусу, у нас паттерн устойчивых колоний на разных чашках был бы разный, а этого не происходит. И никакой математики не надо. Результатом этих экспериментов стало то, что люди навыделяли огромное количество разных мутаций в разных генах кишечной палочки, которая на сегодня является наиболее изученным и излюбленным модельным организмом для молекулярных биологов и микробиологов. Ученые смогли “разделить” ген, оказалось, что можно получать множественные мутации в одном и том же гене, изучать их отношение друг к другу. В конце концов, в результате этой работы было сформулирована “Центральная догма молекулярной биологии”, которая утверждает, что в последовательности ДНК закодирована генетическая информация, ДНК может реплицироваться с сохранением этой информации, но при этом возможны ошибки, однако происходят они не так часто, и ошибки эти - и есть мутации, частота встречаемости которых в популяции зависит от отбора. Информация, которая находится в ДНК, копируется в РНК специальными ферментами под названием РНК-полимеразы, а затем РНК транслируется машиной под названием рибосома в белок. Белок, его активность определяет признаки, которые мы с вами можем видеть: цвет глаз, цвет кожи, вьющиеся или невьющиеся волосы - в случае людей и т.д. В общем, центральная догма полностью соответствует дарвиновскому механизму наследования, эволюции. У нас есть ДНК — депозитарий информации, которaя копируется и передается от поколения к поколению, но копируется с какой-то небольшой вероятностью случайных ошибок. Эти ошибки, которые суть просто изменения в последовательности оснований ДНК, создают изменчивость. Изменчивость проявляет себя в измененной функции белков, что приводит к измененным свойствам организма, на который действует отбор. И никакого ламаркизма здесь нет. Ламаркизм предполагал бы, что есть обратный поток информации от внешней среды на белок, а затем на РНК к ДНК. На сегодняшний день такие механизмы не известны. Результатом развития всех этих представлений стал великий синтез, “неодарвинизм”, который сочетает в себе положения классической генетики, молекулярной биологии и генетики и, собственно, исходных дарвиновских постулатов.

Давайте теперь повторим эксперимент. На слайде помещена фотография, сделанная в Колд Спринг Харборе в начале 70-х. Вы видете постаревшего Сальву Лурию и Джона Кернса. Джон Кернс — это один из крупнейших исследователей ранней молекулярной биологии, связанной с изучением бактерий и их вирусов. В Колд Спринг Харборе собирается масса народа, они выпивают и беседуют друг с другом на разные научные темы. Показанные на фотографии два крупных ученых не гнушаются поговорить с аспирантом, который, кстати, сейчас тоже очень известный исследователь. Это все часть атмосферы Колд Спринг Харбора, которая делает его Меккой современной науки о жизни. Джон Кернс находясь уже в почтенном возрасте (ему было далеко за 60), опубликовал в конце 80-х годов в журнале “Nature” статью, которая называлась “О природе мутаций”. На слайде приведен “Abstract” этой статьи, в котором написано, что “нуклеиновые кислоты реплицируются с очень большой точностью. Однако, иногда в их последовательности происходят изменения, которые мы называем “мутации”, и эти изменения генерируют изменчивость, которая позволяет происходить эволюции.

Эта концепция была разработана в результате изучения вариаций у бактерий. На сегодняшний день (напомню, работа опубликована в 1988 году) считается, что мутации возникают постоянно и спонтанно, не в связи со своей полезностью. "В этой статье, - пишет Кернс, - мы, с одной стороны, обозреваем историю того, как возникла идея спонтанных мутаций у бактерий, а потом делаем эксперименты, которые показывают, что, возможно, клетки все-таки могут контролировать, где и как у них происходят мутации”. Здесь сказано что-то очень важное: ведь как только вы начинаете контролировать, где у вас происходят мутации, вы переходите к ламарковскому механизму. Вы - сознательно или несознательно - выбираете, какие мутации у вас должны произойти, то есть они перестают быть спонтанными. От чтения этой статьи возникает ощущение, что Кернс решил попробовать сделать опыт, который был бы еще проще, чем у Лурии и Дельбрюка, но при этом был бы не менее, а более информативен. Цель его опыта - это попытка найти адаптивные мутации. Я сразу скажу, что опыт Кернса не удался, хотя в последней части лекции я постараюсь вас убедить, что адаптивные мутации у бактерий действительно существуют. Своей статьей Кернс вызвал большой переполох. На сегодняшний день эта статья цитировалась более чем тысячу раз. Национальными институтами здоровья и Национальным научным фондом США было потрачено не менее десятка миллионов долларов в виде грантов очень хорошим ученым, чтобы разобраться, что же все-таки происходит на самом деле. Так как эволюция вызывает сильные чувства у людей не только в России, но и в Америке, было забавно наблюдать, как на экспертной панели одного из Национальных институтов здоровья один ученый обзывал другого коммунистом из-за того, что их мнения по поводу этого эксперимента не совпали. А ведь в Америке худшего оскорбления просто не бывает. Так в чем же, собственно говоря, суть этой статьи? Мы будем отбирать lac+ колонии из lac– популяции все той же самой кишечной палочки. Что это значит на человеческом языке? Оказывается, что у бактерий существует фермент, который кодируется геном lac и этот фермент, продукт генаlac, необходим для того, чтобы клетка могла использовать сахар под названием лактоза как источник пищи. Нормальные клетки дикого типа называются lac+, и они образуют колонии на средах, содержащих лактозу как единственный источник пищи. Это и понятно — раз у них есть фермент, который позволяет использовать лактозу как пищу, то они, конечно, на среде, содержащей лактозу как единственный источник пищи, живут. С другой стороны, мутантные клетки, они называются lac–, не имеют такого фермента, не способны использовать лактозу как источник пищи и поэтому на средах, содержащих лактозу как единственный источник пищи, колоний не образуют. Среда, содержащая лактозу, будет в нашем эксперименте селективной средой. Клетки обоих типов растут на специальных индикаторных средах и образуют колонии разного цвета, при этом клетки дикого типа образуют колонии синего цвета, а мутантные lac– клетки образуют колонии белого цвета. Это все, что нам необходимо знать. Вот такая у нас будет экспериментальная система.

Экспериментальная система: отбор lac+ колоний из lac- популяции

Мы возьмем популяцию lac– клеток и будем отбирать lac+ клетки. У нас не будет 20 культур, как в прошлом опыте. У нас будет только одна чашка — вот она, показана на слайде.

На этой чашке помещена среда с лактозой как единственным источником пищи. Теперь мы на эту чашку высеем очень много lac– клеток, которые здесь расти не должны, потому что они не могут использовать тот источник пищи, который мы им предложили. Для образования видимой глазом колонии из одной клетки-основательницы достаточно ночи, 8-10 часов. По истечении этого времени мы ожидаем увидеть некоторое количество колоний, и эти колонии по определению будут lac+. Это колонии произошли из клеток, которые “ревертировали”, т.е. перешли из исходного состояния lac– в состояние lac+. Такой опыт до Кернса делали много-много раз. Вы вечером ставите чашку, на которую вы высеяли бактерии, в термостат, а утром приходите и считаете колонии. Посчитали - и дальше что-нибудь еще делаете, а чашки выкидываете или ставите в холодильник, где бактерии больше не растут. А Кернс решил их посчитать не только на следующий день, но еще и через день, и через 2 дня, и через 3 дня. Вот и весь его опыт. В чем здесь суть? Если мы считаем, что каждая из колоний, которая выросла на селективной среде, произошла из спонтанно возникших и ранее предсуществовавших lac+ клеток, то все lac+ клетки, которые были высеяны на чашку вечером, должны были образовать колонии на следующий день. А дальше количество колоний должно оставаться постоянным. Но оказывается, что если подождать 2 дня, то возникают еще колонии, три дня — еще. И вот, собственно, в правой части слайда перед вами единственная экспериментальная картинка из статьи Кернса в “Nature”. Из графика видно, что с течением времени наблюдается линейный рост количества колоний: чем больше вы эту чашку держите в термостате, тем больше lac+ колоний возникает. И так как все, что было на чашке с самого начала, должно было вырасти уже в течение первых суток инкубации, мы вынуждены признать, что каким–то образом клетки постепенно “приучаются” или “приручаются” использовать лактозу как источник пищи. Оказывается, что это изменения наследуемы. То есть те клетки, которые выросли во второй и третий день, действительно, lac+, они могут использовать лактозу, они и их потомки теперь все время будут на лактозе расти. Заметьте, что если мы сделаем опыт по Дельбрюку, если мы высеем клетки на среду с фагом, такого не произойдет. Никаких дополнительных колоний, устойчивых к фагу, с течением времени не возникнет. Возникает вопрос: в чем разница?

Реплика из зала: Одних съели, других — нет!

Константин Северинов (фото Н. Четвериковой)
Константин Северинов 
(фото Н. Четвериковой)

Константин Северинов: На самом деле замечательно, что вы это почувствовали. Да, действительно, на чашках с фагом просто атомная война произошла. Все клетки, которые здесь не могли жить, их фаг убил — они просто исчезли. А в случае с лактозой ситуация другая — мы поместили клетки на среду без лактозы, у них нет еды, но отсутствие еды — это не смерть. По крайней мере, не быстрая смерть. Т.е. у нас здесь голодающие клетки сидят, голодают, с завистью смотрят на тех, кто начал расти с самого начала. А потом некоторые из них вдруг получают какой-то стимул, вдохновение - и тоже начинают расти...

Вопрос из зала: Голодная клетка один раз делится или может 2 раза делиться?

Константин Северинов: Она делится какое-то количество раз, но небольшое. Происходит несколько актов деления, да. Это вы в правильном направлении думаете.

Вопрос из зала: Насколько доказано, что все те клетки, которые были высеяны, действительно, lac–? Каким образом они очищаются? Быть может, там затесался lac+?

Константин Северинов: Ну, что значит “затесался”? Затесался — это все равно, что он спонтанно возник. Критерии чистоты микробиологической работы были разработаны еще Кохом в конце XIX века. Культура чистая, если она клональна, если она выделена из одной клетки. Всякая колония, выросшая на чашке, есть потомок единственной клетки. Перед высевом на чашку они у нас сразу и выросли. Те lac+ колонии, которые выросли в первый день на лактозе, ничем в принципе не отличаются от тех, которые здесь выросли на чашках с фагом. Это одно и то же. Это то, что предсуществовало и тут же пустилось в рост на соответствующих селективных средах. Потому что одним из них все равно, есть фаг или нет, а другим все равно, является ли лактоза единственным источником пищи.

Вопрос из зала: Вы хотите сказать, что два механизма присутствуют одновременно?

Константин Северинов: Это не я хочу сказать, это данные говорят. Но это не отменяет вопроса о том, каков механизм возникновения “поздних” lac+ колоний. Возможно, что колонии, возникающие на второй и на третий день, не такие, как предыдущие, у них есть что-то особенное, и такое ощущение, что клетки, которые их образуют, как-то знают, куда им двигаться. Они каким-то образом решают, что они должны стать lac+. Т.е. изменения в этих клетках адаптивны, они не предсуществуют, и, следовательно, они обязаны своим возникновением какому то ламарковскому механизму. Статья Кернса как раз и была попыткой показать, что могут быть адаптивные мутации.

Вопрос из зала: А разве те несчастные голодающие клетки, которые делятся 2-3 раза, могут образовать в результате мутаций такие колонии?

Константин Северинов: Нет, но давайте посмотрим, что происходит.

В чем разница двух опытов? В том, что в опыте Кернса клетки выживают, а в опыте с фагом — нет.

Селекция, которая производилась в опытах Кернса, по-научному называется селекцией в условиях стресса. Оказывается, что стресс, в нашем случае это голодание, вызывает гипермутабельность. Почему возникают мутации? Потому что ваша ДНК реплицируется не очень точно. Логично предположить, что если вам очень плохо, вы голодаете, но тем не менее реплицируете ДНК, то количество ошибок при репликации у вас возрастет, просто потому, что машина, которая реплицирует ДНК, начинает работать менее точно. В данной ситуации это оказывается полезным. Почему? Потому что увеличение количества ошибок увеличивает изменчивость. А увеличенная изменчивость дает дополнительный материал для отбора. Т.е. даже если исходные lac– клетки не содержали необходимых мутаций до высева на среду с лактозой, lac+ мутации могли возникнуть за счет пониженной точности репликации клеток, находящихся на разных стадиях голодания. Надо понимать, что это ненаправленный, т.е., дарвиновский процесс, в ходе которого увеличивается количество всех мутаций. Но из получающейся более разношерстной популяции можно-таки будет выбрать несколько ребят, которые стали такими, как нужно. Это первый механизм возникновения “адаптивных” кернсовских мутаций. Второй механизм называется “амплификация частично функционального мутантного lac гена”. Он более сложный. Я попытаюсь его объяснить; если я буду путаться, то вы, пожалуйста, прерывайте, а я тогда попробую еще раз. Дело в том, что опыт Кернса вовсе не такой простой, как кажется на первый взгляд. Этот опыт был сделан так, чтобы он сработал как надо. Дело в том, что тот испорченный lac ген, с которым работал Кернс, не был испорчен полностью, окончательно и бесповоротно. Продукт мутантного гена работал, но с эффективностью лишь в 2% от активности продукта lac-гена дикого типа. Ситуация схематически показана на слайде. Светло-голубая палочка обозначает испорченный lac ген; этот ген может с вероятностью P перейти в полностью функциональное состояние и, в результате, у вас образуется колония синего цвета. Помните, lac+ колонии образуют колонии синего цвета? — вот такая колония и показана на слайде. Такой переход из lac- в lac+ состояние приводит к образованию колоний, выросших в первый же день, а также колоний, образовавшихся позже за счет гипермутабельности при стрессе. Но существует и другой, более сложный процесс. Оказывается, в клетке вообще, а в особенности в конкретной экспериментальной системе, сознантельно использованной Кернсом, с определенной частотой может происходит дупликация, т.е., удвоение числа копий lac гена.

Реплика из зала: настройка!